野木瓜（Stauntoniachinensis）属蔷薇科灌木丛植物，为中国特有果木之一，素有“百益之果”美称，是贵州省遵义市正安县特有水果。野木瓜皮薄肉厚、风味浓郁、品质优良，富含多种营养成分,包括氨基酸、维生素、多糖、总*酮、多酚类、三萜皂苷类化合物齐墩果酸和酶类，其中酶包括过氧化氢酶、木瓜蛋白酶、超氧化物歧化酶（SOD）等。药理作用方面,野木瓜具有镇痛抗炎、阻滞神经传导、抑制胃肠道平滑肌等药理活性。
以贵州野木瓜为原料，采用三种优势菌群为不同的发酵剂制备野木瓜酵素，并分析不同发酵剂对其主要活性物质(总三萜、总*酮、儿茶素、超氧歧化酶SOD)含量损耗的影响，结果表明：高效酒曲发酵结束后总三萜由6.79mg/mL降低到5.71mg/mL，降低了15.91%，总*酮含量下降了40.00%，儿茶素含量下降了37.78%，SOD活性下降了56.32%；曲王发酵结束后总三萜含量下降了38.73%，总*酮含量下降了58.82%，儿茶素含量下降35.56%，SOD活性下降了42.27%，变化显著(p0.05)；甜酒曲发酵结束后总三萜升高0.74%，总*酮含量下降15.89%，儿茶素含量下降0.11%，SOD活性下降了48.73%。
酵素发酵是一个复杂的混菌发酵体系，其中微生物通过其自身的物质代谢，使发酵原料在分子水平上发生分解和结构改变，产生很多复杂的中间代谢或交叉代谢产物，实现物质之间的代谢转化，产生新的生物活性成分，并代谢产生多种生物酶。发酵剂的优势菌群不同代谢产物也不同，凌空等人研究了果蔬酵素不同发酵周期中微生物：从6个月果蔬酵素中分离鉴定出菌种7株，包括3株乳酸杆菌，4株酵母菌；从12个月果蔬酵素中分离出菌种5株，包括3株乳杆菌和2株酵母；从18个月果蔬酵素中分离出菌种3株酵母。
综上可知，果蔬发酵过程中各位功能活性成分的变化与发酵剂的微生物组成关系重大，因此通过研究不同发酵剂发酵野木瓜酵素后功能成分的变化，可以更好的筛选出适宜的发酵剂。而目前基于野木瓜微生物发酵的研究主要有野木瓜酒，野木瓜醋等工艺方面的研究，目前还没有针对野木瓜酵素发酵过程中活性成分变化的研究。
为了筛选适宜野木瓜酵素发酵的发酵剂，本研究选择优势菌群不同的三种发酵剂，即高效酒曲，甜酒曲，曲王来发酵制备野木瓜酵素，其中高效酒曲以产酯产香的细菌类微生物为主，少量酵母菌，曲王以酵母为主，甜酒曲以产糖化和液化酶类以及酵母，醋酸菌，乳酸菌复配而成。在相同的发酵环境下发酵制备野木瓜酵素，追踪发酵过程中主要的活性成分总三萜，总*酮，儿茶素以及超氧岐化酶SOD的变化。可为更好的指导野木瓜酵素的工业化生产提供理论技术参数。
材料与方法
材料试剂：野木瓜原料，高效酒曲发酵剂，曲王，甜酒曲，发酵辅料（白糖、水、无水乙醇），碘，5%硫酸乙醇溶液、五氧化二磷，硫酸亚铁，过氧化氢，水杨酸，香草醛，冰乙酸，高氯酸，齐墩果酸，芦丁，儿茶素，总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒（羟胺法）。
仪器设备：高效液相色谱仪（Millipore-），打浆机（SKG-PB-），电子天平（BS-S），分析天平（AG)，旋转蒸发仪（EYELA)，超纯水机（Millipore-），鼓风烘箱（GZX-MBE），紫外分光光度计（UV-），离心机（TCL-）。
野木瓜酵素的制备：将成熟的野木瓜洗净去籽，分别称取9份.00g质量相等的鲜果，分别加入两倍量的灭菌蒸馏水打浆，打浆1min，将浆液称重后，倒入已灭菌的三角瓶中，按照浆液质量加入10%白糖，搅拌使白糖完全溶化，按照质量份数为0.5%的添加量，分别添加活化好的三种发酵剂：高效酒曲、甜酒曲、曲王，每种发酵剂做三份平行，搅拌均匀使其溶解，并使其温度在25℃～35℃开始发酵。按照发酵阶段在第0d、第10d、第20d、第30d、第40d取上清液过滤后进行活性成分分析检测。
活性成分分析检测：分别进行总三萜含量测定、总*酮含量测定、儿茶素含量测定、SOD酶活力的测定。
结果与分析
野木瓜酵素发酵过程中总三萜含量变化
由图1可知，野木瓜酵素，总三萜含量整体下降的趋势，发酵前检测到原料中的总三萜含量为6.79mg/mL，采用以酵母为主的曲王发酵的野木瓜酵素由6.79mg/mL降低至4.16mg/mL，变化显著（p≤0.05）；采用以产酯产香的细菌类微生物为主的高效酒曲，在发酵到第10d时，总三萜的含量由降低变为增加，最终由6.79mg/mL降低至5.71mg/mL，变化不显著（p≥0.05）；采用以产糖化和液化酶类以及酵母、醋酸菌、乳酸菌复配而成的甜酒曲，总三萜的含量由先升高后降低，后期又升高，由6.79mg/mL升高至6.84mg/mL。因此合理的选择发酵剂，控制发酵时间可有效的降低发酵过程中功能成分总三萜含量的变化。
图1不同发酵剂发酵野木瓜酵素总三萜含量变化趋势图
野木瓜酵素发酵过程中总*酮含量变化
由图2可知，三种不同的发酵剂发酵野木瓜酵素，总*酮含量都趋于下降的趋势，其中曲王和高效酒曲显著降低（p≤0.05）分别由最初的17.00mg/mL降低至7.00mg/mL和10.20mg/mL，而采用酶和微生物复配的甜酒曲降低不显著（p≥0.05），由最初的17.00mg/mL降低至14.30mg/mL。酵素化的过程其实就是一个微生物提取的过程，不同发酵阶段，优势微生物菌群不同，从图2可知以酵母为主的曲王发酵的野木瓜酵素总*酮含量在发酵全程都降低，总*酮在发酵过程中含量变化不显著，因此选择丰富多样性强的微生物菌群作为野木瓜酵素的发酵剂，可有效的减少酵素化过程中总*酮的变化。
图2不同发酵剂发酵野木瓜酵素总*酮含量变化趋势图
野木瓜酵素发酵过程中儿茶素含量变化
由图3可知，采用高效酒曲发酵野木瓜酵素在发酵前20d的时候含量在一直下降，从20d到30d阶段是升高，在发酵到30d的时候含量高于原料中，微生物的代谢产物会有没食子酸与其中的醇类物质反应生成儿茶素没食子酸酯，而曲王和甜酒曲在发酵第10d的时候儿茶素含量由降低变为升高，这两种发酵剂在第10d的时候完成酒精发酵，乳酸菌和醋酸菌作为优势菌群产生代谢产物，有研究表明乳酸菌在植物自身菌群中占很小部分，但通过它们发酵各种蔬菜、水果等植物性食物，就能显著改变和促进健康功能；乳酸菌参与植物的酚醛树脂代谢、脂肪酸代谢、碳代谢及氮代谢；乳酸菌还可能去除植物性食物中有*的成分，例如植物乳杆菌可水解有*的巢菜核甙及伴蚕豆嘧啶核苷。
通过图3可知，野木瓜酵素从酒精发酵转为乳酸和醋酸发酵后，三种酒曲发酵的野木瓜酵素中儿茶素的含量显著升高（p≤0.05）。综合分析变化过程，可推测野木瓜酵素化过程中会产生没食子酸并与其中的醇类物质反应生成儿茶素没食子酸酯，但需进一步检测。
图3不同发酵剂发酵野木瓜酵素儿茶素含量变化趋势图
野木瓜酵素发酵过程中超氧岐化酶SOD含量变化
野木瓜果实中富含丰富的特征功能物质超氧化物歧化酶SOD，但其在加工和保藏过程中SOD活性容易发生衰减，导致产品功能的下降。因此野木瓜酵素发酵过程中，SOD作为一个功能成分进行研究有助于保持产品的功能稳定。
从图4可知，三种不同的发酵剂发酵野木瓜酵素，SOD酶活先是显著降低，之后逐渐升高。其中高效酒曲在发酵第20d的时候开始升高，而曲王和甜酒曲在发酵第10d的时候开始升高，整个发酵阶段分析可知，野木瓜酵素中SOD的含量趋于降低，由此可知野木瓜酵素原料中含量较高，检测到发酵第1d，野木瓜中超氧化物歧化酶SOD的酶活为.90U/mL。因为超氧化物歧化酶SOD不稳定，在发酵过程中不断的衰减，但是酵素化的过程中，有研究表明通过微生物发酵也可以制备超氧化物歧化酶SOD，侯进慧等人以大蒜为研究对象，添加植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌等三种乳酸菌发酵大蒜，发酵开始后，SOD酶活性有所增加，并保持的较高水平；采用三种不同的发酵剂发酵野木瓜酵素，超氧化物歧化酶SOD的酶活都是先下降又趋于上升趋势然后又有下降的趋势，可以推测在野木瓜酵素发酵过程中，前期微生物代谢缓慢，产超氧化物歧化酶SOD的量低于超氧化物歧化酶SOD衰减的量，而后期微生物代谢旺盛，产SOD的能力大于SOD衰减的进度。
野木瓜酵素发酵过程中总三萜含量变化
图4不同发酵剂发酵野木瓜酵素SOD酶活变化趋势图
结论
通过分析不同发酵剂发酵野木瓜酵素主要活性成分的变化可知，发酵剂对酵素中成分的变化影响显著，三种发酵剂发酵野木瓜酵素过程分为两个阶段，前期以酒精发酵为主，后期以醋酸和乳酸发酵为主。
不同的发酵剂发酵后活性物质成分均有损耗，优势菌群不同，损耗程度有所差异，其中采用酵母菌，醋酸菌，乳酸菌复配而成的甜酒曲发酵结束后活性成分的衰减程度最低，因此，野木瓜酵素工业化生产中可以考虑以酵母菌，醋酸菌，乳酸菌复配而成的发酵剂发酵野木瓜酵素。
因此，发酵剂是影响酵素品质的关键因素，功能性发酵菌株的筛选和优化是发酵果蔬制品研发的关键，建立果蔬发酵益生菌资源库、采用多菌种协同发酵以发挥多种益生菌的功效，针对不同的果蔬创制直投式的复配发酵剂是发展趋势。
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